Как правильно: Сотрудники в отпуске или в отпуску?

Правильно надо говорить и писать: в отпуске (хотя в живой речи и распространено "в отпуску"), потому что за окончанием предложного падежа (-у) существительных мужского рода в закреплена функция обозначать какое-то определенное время или место, или «образ действия»: в прошлом году, во втором часу; в пруду; на лету (кстати, во всех этих случаях используется предлог в или на).

Вообще, существительные мужского рода, принимающие в предложном падеже единственного числа форму на (-у) как правило, односложные: ход, лес, бег. Это объясняется тем, что окончание (-у) всегда под ударением, а для слов с неподвижным ударением такая перестановка неприемлема.

Итак – все сотрудники в отпуске!